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1. western blotting的原理、操作步骤及意义

1、western blotting的原理、操作步骤及意义

western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western可以参考如下步骤进行操作。

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上。再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

- 将凝胶浸入转移缓冲液中平衡，若检测小分子蛋白可省略此步骤。- 根据胶的大小裁剪膜和滤纸，平衡后放入转移缓冲液中。- 组装转移三明治，注意胶面朝下放置于膜上。- 在冰浴中进行蛋白质转移，使用适当的电压和时间。- 转移完成后，关闭电源，取出杂交膜。

精确操作的步骤如下：蛋白质上样：温度控制至关重要，务必避免高温，确保上清比例准确，快速加入缓冲液，严格按照指南进行。变性与保存：经过5-10分钟的煮沸，蛋白质得以变性，然后冷藏处理，分装储存，防止反复冻融对蛋白质结构的影响。

用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物 鲁米诺，如遇到HRP，即发光，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

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